02. פירוט נזקים של הרדיקליים החופשיים


מודיפיקציה של חלבונים:

החלבונים הם המטרה העיקרית לתקיפות הרדיקלים החופשיים, בגלל זמינותם הגבוהה, ובגלל שהם קודם כל אחראים לכל התהליכים התיפקודיים הנעשים בתאי הגוף החי. מודיפיקציה של חלבון עלולה לשנות אותו, בכל רמה של מבנהו, מהמבנה הראשוני עד המבנה הרביעוני, וליגרום שם לשינויים מבניים. נזק חימצוני מושרה באופן ישיר או באופן בלתי ישיר: חלבונים שעברו מודיפיקציות על ידי הרדיקלים החופשיים, הם בעיקר חלבונים שהם  S-גלוטתיוניים, או מחוברי גלוטתיון, או שעברו חימצון טירוזין, ניטרציה, והאלוגנציה. מימן פראוקסיד עלול לגרום נזקים ישירים לחלבונים על ידי חימצון קבוצות סולפהידריל  ( SH-) שעל פניהם. כל שינויים האלה משנים את המבנה הסטרי של החלבון, ואז קטן תיפקודו, עד לאובדן מלא של פעילותו. 

נמצא גם שריאקציות של מוצרים מישניים הביאה לפיצול השלד הפפטידי של החלבון, או לשבירתו, לקשרים צולבים, או לשינוי הרגישות לאנזימים פרוטאוליטיים (מפרקי חלבון), ו\או למודיפיקציה של השרשרות הצדדיות של כמעט כל חומצה אמינית. רדיקלים גרמו ליצירת קבוצות מגיבות חדשות בחלבונים (מחומצות האמינו טירוזין, ציסטאין, היסטידין, פרולין, ליזין, ארגינין, טריפטופאן, פנילאלנין, וואלין) או על ידי יצירת חלבונים קרבוניליים. 

את רוב הנזק בחלבונים ניתן לכנות כ- total loss, אינו ניתן לתיקון, ויתכן שיהיו בו מיגוון תוצאות בהמשך, שישפיעו על תיפקוד של קולטנים, אנזימים, חלבוני טרנספורט, וכיוב' וכן ליצור אנטיגנים חדשים, המעוררים תגובה חיסונית (שעלולה להיות כנגד מרכיבי הגוף עצמו, במחלות חיסון עצמי). בפגיעה החימצונית עלול להיגרם נזק מישני לביו-מוליקולות אחרות, כגון, אינאקטיבציה של אנזימים מתקני DNA, ואובדן הנאמנות של DNA-פולימראז פגוע, בהכפלת ה- DNA.

 

מודיפיקציה של DNA

רדיקלים חופשיים גורמים לנזק ל- DNA, בכמה צורות: שברים, חד ודו גדיליים, (כאשר שברים דו גדיליים הם סופניים לגבי התא), קשרים צולבים בתוך גדילי ה- DNA, או בין שני הגדילים של ה- DNA,  בין DNA- וחלבון, וכן כ-20 מודיפיקציות של בסיסים, וסוכרים המחוברים אליהם. כאן פעיל ביותר הוא, כאמור, הרדיקל ההידרוקסילי (OH•).  נזק ל- DNA, ניגרם גם על ידי סוגי חנקן מגיב  (RNS ), הגורמים בעיקר לניטרציה ודאמינציה של בסיסי הפורינים (גואנין  ואדנין). התוצאה של הנזק ב- DNA, היא בהגדלת הסיכון למוטגנזיס, וקרצינוגנזיס. 

נזק חימצוני ל- DNA מתוקן על ידי מערכות תיקון תאיות: בסיסי ה- DNA הפגועים, מתוקנים, על ידי סילוק הבסיס (base excision), והחלפתו בבסיס הנכון. זה אינו מושלם, כך שנישארות מוטציות, והן מצטברות.

 
פראוקסידציה (חימצון) של ליפידים

רדיקל ההידרוקסיל יכול לפעול עם מוליקולות ליפידיות (אלקיליות, LH ) המובנות בממברנות של התאים, כדי ליצור מוליקולות רדיקלים ליפידיים (2009 Best ) לפי הנוסחא:

      OH + LH → L + H2O

בחימצון ליפידים בממברנת התא, יצירת רדיקל פרוקסיל, מרדיקל אלקיל, נעשית לפי הנוסחא:


איור - יצירת רדיקל פרוקסיל מרדיקל אלקיל


כאן רדיקלי ליפידים אלקיליים פועלים ישירות עם חמצן (חימצון עצמי) בתהליך ריאקציה של שרשרת הגדלה מעצמה ויוצרת את הפראוקסיד ליפידיים (ליפיד פראוקסיל רדיקלים, או מוליקולות ליפידים המכילות קבוצות של זוגות אטומי חמצן  ( −−OO−− ) לפי הנוסחאות:

L + O2 → LOO
LOO + LH → LOOH + L 

הריאקציה הראשונה מהירה פי 1,500 עם חמצן יחידני (1O2), מאשר עם חמצן שלשתי (3O2). החמצן היחידני הוא אנרגטי מספיק, אולם, שהוא יכול לפעול ישירות עם הקשרים הכפולים של חומצות שומניות בלתי רוויות, ללא צורך במתווך רדיקל חופשי. הליפיד הידרופראוקסידים (LOOH) יכולים לעודד ריאקציית Fenton (ראה לעיל), לפי הנוסחא:

Fe2+ + LOOH + H+ → Fe3+ + OL. + H2O

הרדיקל ליפיד אלוקסיל (alkoxy = alkoxyl =OL) יותר פעיל, ומזיק מאשר רדיקל ליפיד פרוקסיל (peroxyl) או פראוקסיד (•peroxy = peroxyl = LOO). לכן על ידי רצף קטן של שלבים, רדיקל חופשי אחד (•L), הופך להיות שני רדיקלים (•L ו-  •OL)- בתנאים של ריאקצית שרשרת המכפילה את עצמה. למרות זאת, אם שתי מוליקולות של רדיקלים אלקיל, אלקוקסיל, או פראוקסיל מתנגשות, הן יבטלו אחת את השנייה, אולם במחיר של יצירת קשר צולב (קשר קוולנטי) בין שני הליפידים. הריאקציות העיקריות הקורות בפראוקסידציה של הליפידים, מתוארת בתרשים הבא:

איור - מסלולים עיקריים בפראוקסידציה של ליפידים (Sachdev and Davies 2008)

רואים שבתהליך המורכב של פראוקסידציה של ליפידים, נוצרים מיגוון רחב של מוצרים, בכמויות שונות, שחלקם מופיעים בתרשים לעיל. למעשה נוצרים שם, בנוסף למאלונדיאלדהיד ( MDA ), מוצרים נוספים הכוללים: 2-פרופנאל (acrolein), איזופרוסטאנים, α, β, אלדהידים בלתי רוויים מגיבים, כגון, 4-הידרוקסי-2-נונאנאל (nonenal, HNE), איזופרוסטאנים (isoprostanes). וכן, פנטאן, אתאן או הקסאן. 

הפראוקסידציה של ליפידים בחומצות שומניות רב-בלתי רוויות, שנחשפות לחמצן, גורם לעיפוש מזונות, וכשניפגעות חומצות אלו המובנות בממברנות התאים, הן מאבדות את כושר החדירות הסלקטיבית, ונעשות שקיפות למעבר חומרים, ולא פונקציונליות. פראוקסידציה של ליפידים גם גורמת גם ליצירת חמצן יחידני, הידרופראוקסידים, ואפוקסידים של ליפידים. בנוסף לכך, נוצרים גם כאמור, אלדהידים מזיקים רבים, בפרט :

MalonDiAldhyde = MDA, propanedial, and 4-HydroxyNonEnal, 4-HNE

ה- MDA (מאלונאלדהיד) הוא מטבוליט של (arachidonic acid (20:4 (חומצה שומנית עם שרשרת של 20 פחמנים, ו- 4 קשרים כפולים, ראה תרשים להלן). קביעת ה- MDA, ידועה כ- (TBARS (ThioBarbituric Acid-Reacting Substances, ניכנסה לשימוש נירחב כמדידה של מידת הפראוקסידציה של הליפידים בממברנות התאים. היא מבוססת על הריאקציה של MDA עם חומצה תיובארביטורית ( TBA ), שיוצרים אדוקט MDA-TBA2, הבולע היטב אור באורך גל מסויים. הבעייה, שרוב ה-TBA המגיב בנוזלי הגוף, אינו שייך לפראוקסידציה של ליפידים. קביעת ה- TBARS יכולה לשמש כסמן כללי לפראוקסידציה של ליפידים, בידיעה שהיא עלולה להראות כאילו יש יותר פראוקסידציה של ליפידים. 

ה- גם הוא מוצר של חימצון עצמי של חומצות שומן 20:4. הוא מגיב עם מרכיבים תאיים יותר חזק מאשר ה- MDA, דהיינו הוא רעיל מאד, בהרבה יותר מאשר ה- MDA, והוא האלדהיד הכי רעיל הידוע, שנוצר על ידי פראוקסידציה של ליפידים. אולם עדיין למעשה לא מגיב עם TBA (כ- 95% מפעילות ה- TBA, היא בגלל ה- MDA) וזה מראה על מיגרעת בקביעת ה- TBARS כשיטה לקביעת פראוקסידציה של ליפיד (Dianzani 1985 ). 


יצירת MDA בפראוקסידציה של ליפידים

האלדהידים MDA , 4−HNE, והאחרים, שלא כמו הרדיקלים החופשיים, חיים זמן רב, ויכולים להיסחף רחוק מהממברנות של התאים, ולהזיק למיגוון גדול של חלבונים, ליפידים, וחומצות גרעין (Esterbauer et al 1991). מוצרי הפראוקסידציה של הליפידים, משרים יצירת אדוקטים עם בסיסי ה- DNA, כפי שמודגם בסכימה הבאה:

איור - יצירת אדוקטים של מוצרי הפראוקסידציה של ליפידים, עם DNA 


השלבים ליצירת האלדהידים העיקריים, נראים בתרשים הבא:

איור - השלבים ליצירת האלדהידים העיקריים

האלדהידים הליפידיים יציבים, יחסית, אולם הם מגיבים, ועלולים לדפוז (להסתנן) לפנים התא, או להימלט ממנו, ולתקוף מטרות רחוקות מאתרי יצירתם. הם נחשבים כ-"שליחים ציטוטוקסיים משניים". הם יכולים להגיב עם מאקרומוליקולות שונות, כולל חלבונים, DNA, ופוספוליפידים, וליצור איתם תירכובות יציבות: הם מגיבים עם חומצות אמינו, (בעיקר ציסטאין, היסטידין וליזין), ולגרום למודיפיקציה של מבנים חלבוניים ותיפקודיהם. הם יכולים ליצור קשרים צולבים עם ליפידים בממברנות התאים, וליגרום הפרעות במבנה ובזרימתיות שלהן. הם יכולים להגיב עם DNA, וליצור איתו אדוקטים רבים, בעלי אפקטים מוטגניים וקרצינוגניים. 

בתהליך לא אנזימטי של פראוקסידציה של חומצות שומניות חומצות שומניות רב-בלתי רוויות (עם 3 או 4 קשרים כפולים), המזורז על ידי רדיקלים חופשיים נוצרים גם איזופרוסטאנים. (הדומים לפרוסטאגלנדידים): כך קורה בחומצה לינולאית (C18:3 ω3), חומצה אראכידונית (C20:4 ω6), וחומצה אייקוזאפנטאנואית (C20:5 ω3). האיזופרוסטאנים מזיקים בכווצם כלי דם, כנראה על ידי הפעלת אנלוגים של קולטנים, או זהים לאלה של תרומבוקסאן. וכן, יוצרים אדוקטים עם קבוצות תיול, שיוצרים אדוקטים עם גלטתיון ועם חלבונים. האיזופרוסטאנים יוצרים גם אדוקטים עם שיירי ליזין בחלבונים, וכך משרים יצירת קשרים צולבים בחלבון, ואיבוד פעילותו (Comporti et al 2008).

ה-, מעכב את האנזים glucose−6−phosphate dehydrogenase) G6PD) הדרוש ליצירת NADPH, ויצירת שיירי ריבוז עבור הביוסינתיזה של חומצות גרעין (DNA,ו- RNA ). יצירת גשר אלדהידי גורמת ליצירת קשר צולב של חלבון-חלבון, הקשור ביצירת lipofuscin (המצטבר ככתמי זיקנה על העור). חומצות שומניות רב-בלתי רוויות, פגיעות מהרדיקלים החופשיים, יותר מאשר מאקרומוליקולות אחרות הנימצאות בתאי הגוף, והרגישות לנזק מהרדיקלים החופשיים גדל באופן אקספוננציאלי, עם המספר של הקשרים הכפולים. מחקרים על ליפידים בכבד של יונקים ועופות, הראו שיש יחס הפוך בין תוחלת חיים, לבין מספר הקשרים הכפולים (Pamplona et al 2000). למרות זאת, אי-רוויה של פוספוליפידים במוח לא מישתנה הרבה בין היונקים, וזה כנראה מצביע על החשיבות של חומצות שומניות בלתי רוויות, לתיפקודי העצבים (Hulbert et al 2002). 

 

חימצון הממברנות השומניות של התאים. 

חומצות שומניות רב-לא רוויות (PUFAs), שכיחות בממברנה השומנית של תאי הגוף, ובליפופרוטאין הפחות צפוף (LDL), ומאפשרות את המבנה הזרימתי של הממברנה. הרדיקלים החופשיים מעדיפים לגנוב אלאקטרונים מהממברנה הזו. כאן מתחילה תקיפה על התא בפראוקסידציה של שומנים. ה- ROS מכוונים את תקיפתם לקשר הכפול פחמן-פחמן, של חומצות השומניות הרב-לא רוויות. הקשר הכפול הזה, מחליש את הקשר פחמן-מימן, ומאפשר הפרדה קלה של המימן על ידי רדיקל חופשי. האחרון גונב את האלקטרון היחיד של המימן הקשור עם הפחמן, בקשר הכפול. זה משאיר את את הפחמן עם אלקטרון בלתי מזווג, ובכך הוא נעשה רדיקל חופשי. במאמץ לייצב את הרדיקל החופשי שפחמן במרכזו, מתבצע סידור מחדש במוליקולה, למצב של דיאן מחובר (conjugated diene (CD, שהוא מגיב בקלות יתרה עם חמצן, ליצור רדיקל פראוקסי. זה גונב אלקטרון ממוליקולה ליפידית (שומנית) אחרת, בתהליך הפצה (propagation), הממשיך בתגובת שרשרת. 

כדי לחקור מצב של דחק חימצוני, נותנים לחולדות פחמן טטראכלורי CCl4, הוא משרה יצירת רדיקלים חופשיים בכבד וברקמות אחרות. חיתוכו בכבד יוצר רדיקל טריכלורומתילי  (CCl3), וזה בנוכחות חמצן הופך להיות רדיקל פראוקסי טריכלורומתילי  (CCl3OO). רדיקלים אלה בהיותם מסיסים בליפידים, יכולים להתחבר לשומנים וחלבונים ברטיקולום האנדופלזמטי בתאי הכבד, ולהתחיל פראוקסידציה של ליפידים. (Comporti et al 2008) 


אפקטים פיזיולוגיים של הרדיקלים החופשיים 

בכל תא בגוף האדם קורות בממוצע כ- 10,000 פגיעות חימצון ב- DNA, במשך 24 שעות (1995 Ames), שניגרמות על ידי ה- ROS. אליהן ניתן להוסיף פגיעות ב- DNA בגלל הידרוליזה, אלקילציה, קרינות, או כימיקלים רעילים. פגיעות אלה מתבטאות בשינוי סדר הבסיסים ב- DNA, שרובם מתוקנים על ידי מערכת מתוחכמת ומהירה, אולם חלק קטן נשאר כמוטציות קבועות. חשיפה לזיהום כימי, או לקרינות אלקטרומגנטיות, מגדילה את מספר פגיעות החימצון, על ידי רדיקלים חופשיים. מוטציות אלו מצטברות, ולבסוף גורמות לחוסר תיפקוד תאי, או אובדן שליטה בגנים, מהם חשובות הפגיעות בגנים קדם מסרטנים (המשתתפים בחלוקות התאים), עד שאחד או יותר מתחילים לגרום לחלוקות תא בלתי נישלטות, דהיינו התא עבר התמרה סרטנית, ויוצר שבט סרטני. רובם של אלה מושמדים על ידי מערכת לדיכוי גידולים, לפני שמופיע גידול סרטני. אולם, אם הגנים של מערכת זו ניפגעים, נשארות יותר מוטציות והפגיעות מגיעות טרם זמנן, בגיל יותר צעיר. בנוסף למחלות סרטניות, הפגיעות מתבטאות גם בהופעת מחלות ניוון עצבי (אלצהיימר, פרקינסון, הנטינגטון ואחרות), וכן בהאצת טרשת עורקים, עליית לחץ דם, מחלות לב, התקפי לב, שבץ מוחי, וכיוב'. בחולדה יש ביממה פי 10 פגיעות חימצון יותר מאשר באדם, דהיינו כ- 100,000 פגיעות ביממה בממוצע בכל תא, לכן כבר בגיל שנה מופיעים אצלן גידולים סרטניים, ותוחלת חייהן כשנתיים. 

הנזק ל- DNA מפריע לביטוי גנים, על ידי כך שמונע טרנסקריפציה (שיעתוק) של  גדיל אחד של ה- DNA   ל-   mRNA  (שעליו נוצרים החלבונים על ידי הריבוזומים) , בעוד שמוטציות בדרך כלל מאפשרות טרנקריפציה, אלא שנוצרים חלבונים שונים מהטבעיים, שתיפקודם חלקי או חסר לגמרי. מוטציות שאינן גורמות למות התא, נוטות להישאר באופן קבוע בתאים המתחלקים. נזק ל- DNA יותר מאשר מוטציות נחשב כסיבה עיקרית להיזדקנות. 


מנגנון הנזק החימצוני לבסיסי ה- DNA 

מודיפיקציות של  DNA ניכרות ביצירת מוליקולות המשמשות כסמנים משמשים למדידת מודיפיקציות אלו. הסמן הנפוץ ביותר הוא 8-הידרוקסי-'2-דאוקסיגואנין ( ), שנוצר מחימצון גואנין שהושרה על ידי רדיקלים חופשיים, ומשמש כסמן של  נזק חימצוני לגואנין של כל הגוף, כמתואר בנוסחא הבאה:


ה- DNA שניפגע בחימצון, או באופנים אחרים, מתוקן באופן מתמשך, ובסיסי DNA מחומצנים, כגון (הניראה מימין), מופרשים דרך הדם והשתן. הם ניקבעים בטכניקות של HPLC, ו- MS (ספקטרומטר מאסות). 

את המנגנון העיקרי לפגיעה ב- DNA, רואים גם בנוסחא לעיל, בפגיעת הרדיקל החופשי הידרוקסיל (•OH), שהוא כאמור, הפעיל ביותר, מגיב עם ה- DNA, על ידי שמתחבר לקשרים הכפולים של בסיסי ה- DNA, וגם על ידי החסרת אטום H (מימן) מקבוצת המתיל (CH3)של הבסיס הפירימידיני תימין של ה- DNA, ובכל אחד מקשרי C-H של ה-  (הסוכר הקשור לבסיס החנקני). ההתחברות לקשרים הכפולים של בסיסי ה-DNA, תלוייה בדיפוזיה, והיא בשיעור קבוע של  כ 3-10x109M-1s-1 והשיעור הקבוע של החסרת פרוטון (+H) הוא 2x109M-1s-1  (במחקר Cooke et al 2003).

ההתחברות לקשר כפול C5=C6 של הבסיסים הפירימידינים (תימין וציטוזין) גורם ליצירת רדיקלי קירוב  (adducts C5-OH) ו- C6-OH ואילו חיסור פרוטון מבסיס תימין, גורם ליצירת רדיקל allyl. רדיקלי הקירוב שונים בתכונות הרדוקס שלהם: אלה של C5-OH מחזרים, ואלה של ה- C6-OH – מחמצנים. 

הנזקים העיקריים הניגרמים ל- DNA, לבסיסים, לסוכרים, ולשיירי החומצה הזרחתית, מתוארים בסכימה הבאה:

איור - הנזקים העיקריים הניגרמים ל- DNA, לבסיסים, לסוכרים, ולשיירי החומצה הזרחתית


טיפוסי הנזקים שניגרמים ל- DNA:

 הנזקים ל- DNA, נגרמים בבסיסים: אדנין A, תימין T, גואנין G, וציטוזין C, אך גם בסוכרים (דאוקסיריבוז) הקשורים אליהם, ובחיבוריהם בחומצה הזרחתית (פוספט). פגיעה בחיבור בין סוכר לחומצה זרחתי, גורם לשבר חד גדילי. פגיעה יותר חמורה, עלולה לגרום שבר דו-גדילי. נוצרים גם גשרים באותו גדיל, שהם בין הבסיסים, או באמצעות מגשר כימי, או גשר בין שני הגדילים, או בין ה- DNA לחלבון. פירוט נוסף נמצא בטקסט בהקשרים המתאימים. 

הרדיקלים של הפירימידינים אינם אחידים, הם נוצרים על ידי מנגנונים שונים. המגמה של רדיקלים מחוזרים או מחומצנים ניקבעת בהתאם לתכונות הרדוקס שלהם, ושל סביבתם, והתגובה של בני הזוג שלהם. טיפוסי המוצרים וכמה נוצר מכל אחד, תלוי בנוכחות או בהיעדר חמצן, ובתנאים נוספים: בחוסר חמצן, נעשה חימצון של רדיקלי הקירוב C5-OH, על ידי תוספת -OH (או תוספת מים H2O), שאחריה יש הסרת פרוטון, הגורמת ליצירת cytosine glycol או thymine glycol, המוצגים באיור הבא (למטה) בשורות 1, ו- 2.

הרדיקל האלילי הופך ל-. הרדיקלים ה- C5-OH-6-peroxy נוצרים על ידי הוספת חמצן לרדיקל הקירוב C5-OH, בשיעורים הנישלטים, כאמור על ידי הדיפוזיה. הרדיקלים הפראוקסילים מסלקים •O2', ומגיבים עם מים (הוספת OH') ליצירת cytosine glycol ו- thymine glycol. החמצן מגיב עם רדיקל האליל, ליצירת  , וגם . הרדיקלים thymine peroxyl, מחוזרים, ומוסר מהם פרוטון, ונוצרים מהם hydroxyhydroperoxides שמתפרקים ונוצרים מהם thymine glycol, 5-hydroxymethyluracil, 5-formyluracil, ו-hydroxy-5-methylhydantoin. מוצרים של ציטוזין, עלולים לעבור דאמינציה (איבוד קבוצה אמינית NH2 ), ודהידרציה (איבוד מוליקולת מים). ה- cytosine glycol עובר דאמינציה ונוצרים ממנו  ו- , המוצגים גם הם באיור הבא. אולם ניתגלה שגם    cytosine glycol, 5-hydroxycytosine, ו-, ניתן למצוא בציטוזין שנחשף לקרינה מייננת. זה הצביע על כך שכל שלושת תירכובות אלו עלולות להיווצר באופן סימולטני ב- DNA, שניזוק. בחוסר חמצן עלולים רדיקלי הקירוב C5-OH להיות מחוזרים, ולאחריו לאבד פרוטון, ליצור  . ביניהם ה- 
 מאבד בקלות קבוצת אמין (NH2) והופך ל- . באופן דומה רדיקלי קירוב C6-OH של פירימידינים הופכים ל- . מוצרים אלה אופייניים לתנאי חוסר חמצן, כיוון שהחמצן מעכב את יצירתם על ידי כך שמגיב עם רדיקלי הקירוב עם OH. 

בניגוד לכך,ה-pyrimidine glycols, ו- נוצרים גם בתנאים חמצניים וגם בחוסר חמצן. מרדיקלי הציטוזין C5-OH-6-peroxyl, ו-C6-OH-5-peroxyl, נוצרות גם שתי התירכובות: 4amino-5-hydroxy-2,6(1H,5H)-pyrimidinedione, ו-, בהתאמה. 

גילוי הרדיקל האחרון, וחומצה isodialuric, ב- DNA, מצביעה על כך ששתי התירכובות עלולות להתקיים באותו זמן ב- DNA. החמצן מחמצן את החומצה ה- dialuric, ל- alloxan והוא אושר כמוצר פירוק של DNA,
  (Dizdaroglu et al 1993). דקרבוקסילציה (סילוק קרבוקסיל= COOH )מה- alloxan, נותן בטיפול חומצי 4. ציקליזציה תוך מוליקולרית של cytosine C5-OH-6-hydroperoxide יוצרת בסיכום מהציטוזין בעיקר  trans-1-carbamoyl-2-oxo-4,5-dihydroxyimidazolidine . אולם בסך הכל תרכובת זו היא מוצר שולי ב- DNA. הוספת רדיקל ההידרוקסיל לעמדות 4C, 5C, ו-8C של פורינים, יוצרת רדיקלי קירוב (adduct) עם ה- OH. הפגיעה של רדיקל ההידרוקסיל באדנין יוצרת לפחות שני רדיקלי קירוב: C4-OH, ו- C8-OH. רדיקלי הקירוב C4-OH , ו- C5-OH שנוצרו מהפורינים, עוברים דהידרציה, והופכים להיות רדיקל•(oxidizing purine(-H, שמחוזר ומאבד פרוטון, וחוזר להיות פורין. לרדיקלי הקירוב C4-OH, יש יכולת לחמצן, בעוד ה- C5-OH, וה- C8-OH, הם קודם כל מחזרים. מאידך מיבנים מזומריים (רזוננטיים) של רדיקלים אלה יכולים להיות מחמצנים או מחזרים. 

זוהי תופעה הנקראת אמביוואלנטיות של רדוקס (redox ambivalence). קבועי הדהידרציה של רדיקלי הקירוב C4-OH, של הגואנין והאדנין , ב- pH נאוטרלי, הם בין 1.5x105 s -1 ו- 6x103 s -1 , בהתאמה. הקטיון גואנין רדיקל (+•guanine) , נוצר על ידי סילוק -OH מרדיקל הקירוב C4-OH של הגואנין (k=6x103 s–1) ויכול לאבד פרוטון, בתלות ב- pH, כדי להפוך ל- •(guanine(-H. הרדיקל קטיון לא עובר הידרציה כדי לתת רדיקל קירוב C8-OH, ואז ל- 

  (נראה בתרשים הבא כ- על ידי חימצון. מוצרים של בסיסי ה- DNA שנוצרו בתגובה ל- ROS, ורדיקלים חופשיים אחרים, אולם, אלה עלולים להגיב עם ב- DNA, על ידי החסרת מימן      (k<4x103 s–1) שגורם לשברים בגדיל של ה- DNA. מאידך, הידרציה של ה- guanine•+ בתוך DNA דו גדילי, רדיקלי קירוב C8-OH שיוצר על ידי חימצון 8-OH-Gua. רדיקל הקירוב C4-OH של הגואנין, לא מגיב באופן מעשי עם חמצן (k<106 M–1s–1), אולם חמצן מתווסף ל- H) • guanine-), בקצב קבוע של 3x109 M–1s–1. התגובה של •(guanine(-H עם חמצן, יוצרת ניגזרות של imidazolone ו- oxazolone . אולם זה לא הוכח על ידי pulse radiolysis , ומנגנון אחר הוצע לכך. רדיקל הקירוב C4-OH של אדנין, מגיב עם חמצן בקצב קבוע של  3x109 M–1s–1 ויוצר מוצרים שעדיין בלתי ידועים. רדיקלי הקירוב C8-OH של הפורינים עלולים להתחמצן על ידי חמצן ומחמצנים אחרים. בניגוד לרדיקלי הקירוב C4-OH, התגובה שלהם עם חמצן נישלטת על ידי הדיפוזיה בקצב  (k≈4 x109 M–1s–1 (Vieira and Steenken 1990. חימצון של אלקטרון אחד, גורם ב- DNA ליצירה של  ו-  (Breen and Murphy 1995 )  אולם יצירה של  נעשית גם בהיעדר חמצן, אולם בשיעור נמוך יותר. 

תוצרי החימצון של כל בסיסי ה- DNA, מפורטים בתרשים הבא:

איור - תוצרי החימצון מבסיסי ה- DNA, שהתחברו עם חמצן מגיב, ועם סוגי רדיקלים חופשיים.


חימצון רדיקלי הקירוב C8-OH, מתחרה בפתיחה חד מוליקולרית של טבעת ה- imidazole, על ידי חיתוך הקשר

 C8-N9, בקצב 2x105 s–1. חיזור של אלקטרון אחד של הרדיקל שטבעתו ניפתחה, מביא ל-  מהגואנין, ו-  מהאדנין (בתרשים לעיל ). חיזור של אלקטרון אחד של רדיקלי הקירוב C8-OH ללא פתיחת טבעת, עלול גם כן לקרות, וליצור. תירכובות אלו הן hemiorthoamides, ועלולות להפוך ל- formamidopyrimidines. ה- , וה- formamidopyrimidines, נוצרות ב- DNA, גם בנוכחות חמצן וגם בהיעדרו. אולם, יצירת ה- , מועדפת בנוכחות חמצן. יתר על כן, תנאים ניסיוניים אחרים, השפיעו באופן בולט על יבוליהם, כגון, נוכחות או היעדר מחמצנים. נוצר גם ב- DNA, מאדנין, במנגנון אפשרי, הכולל תקיפת OH• עמדה C2  לאדנין, שאחריה יש חימצון. ריאקציות של פירימידינים (ציטוזין ותימין), ופורינים (אדנין וגואנין) נותנות מוצרים מרובים ב- DNA, כמתואר בתרשים לעיל. רוב הבסיסים האלה שעברו מודיפיקציה, שזוהו ב- DNA, הן במבחנה, והן בתרביות תאים, בחשיפה למערכות המייצרות רדיקלים חופשיים. ריאקציה אחרת של בסיסים ורדיקלים, היא הוספת חומצה אמינית ארומטית, הנמצאת בחלבונים, או בקומבינציה עם רדיקל של חומצה אמינית, המביא ליצירת קשרים צולבים בין DNA וחלבון. ריאקציות של OH•, עם שייר סוכרי של ה- DNA, על ידי חיסור H, גורם למודיפיקציות של הסוכר, ולשברים בגדילי ה- DNA. המנגנונים של ריאקציות אלו תוארו בפירוט, במקום אחר (Sonntag 1987). ריאקציה מיוחדת במינה של רדיקל שבמרכזו 5C סוכר, היא התוספת לעמדה 8C של הפורין, טבעת של אותו נוקלאוזיד (בסיס DNA). ריאקציה זו מביאה לציקליזציה תוך מוליקולרית, ואז, על ידי חימצון,. 

גם ה-5'R' ,של ה-  ו- , נוצרים ב-DNA. 

הבסיסים שעברו מודיפיקציות: ה-  ו-  זוהו שניהם בתאי אדם שנחשפו לקרינה מייננת. תירכובות אלו מייצגות נזקים המתלווים גם בבסיסים, וגם בשיירי הסוכר, ונחשבים כפגיעות טאנדם על גדיל ה- DNA. חמצן מעכב את יצירתם על ידי כך שפועל עם הרדיקל שבמרכזו סוכר C5 , לפני הציקליזציה. 

כששינויים אלה אינם עבור ההגנות של התא, כגון מוליקולות קטנות של נוגדי חימצון, נוגדי חימצון אנזימטיים, ותיקון DNA, הרמות של הבסיסים שעברו מודיפיקציה חימצונית, ייצגו במהירות את רוב הבסיסים ב- DNA. המערכות נוגדות החימצון הוכרו מזה שנים רבות, והן הוגדרו היטב. בניגוד לכך, למרות שמנגנון תיקון ה- DNA דווח כבר לפני שנים אחדות, בעשור האחרון, נוספו מחקרים רבים שכוונו במאמץ לגלות את התהליכים הנעשים בתיקון ה- DNA לפירטיהם. 


דרכים אלטרנטיביות למוטציות 

מעצור בהכפלת ה- DNA 

תימידין גלייקול (Tg) מופיע בעיקר כאיזומר cis (על אותו גדיל של DNA). הספציפיות למוטציות אלו נחקרה בחיידקים ובתרביות תאי יונקים. חלק מהמוטציות היו קשורות ב-Tg, אבל ההסכמה הכללית היא שאין לו פוטנציאל מוטגני מובהק. מחקרים אחרונים הראו שיותר מהיות ה- Tgמוטגני, הוא בולם רפליקציה (הכפלת ה- DNA), בנוקלאוטיד (בסיס של ה-DNA) אחד לפני אחד אחרי מקום הפגיעה. 


חיסור בסיסים ב- DNA 

חקר המוטגניות של , העלה תוצאות מנוגדות. למרות שאינו רעיל באופן מובהק לתאי הגוף, המוטגניות שלו הוסקה לפי נוכחות אנזים הפועל לתיקון מוטציה זו. במקום להשרות מוטציות נקודתיות, נמצא שהוא גרם לאיבוד קטעים גדולים או בינוניים ב- DNA בתאי יונקים בתרבית. אולם מוטציות אלו לא נתקבלו כתוצאה מזיווג שגוי בין גדילי ה- DNA, או מחוסר קליטת בסיסים לתוך ה- DNA, במקום זאת, נראה שתיקון תוך סילוק על ידי האנזים , עשוי לגרום לחוסרים אלה. יצירת מיקרולווינים בלתי יציבים\אובדן של הטרוזיגוטיות בתאים נורמיליים, האורך של הרצפים החוזרים ב- DNA, שכך ניקראים המיקרולווינים, הוא קבוע, אבל אורך הקטעים החוזרים יכול להיות שונה בתאי גידולים סרטניים. אי היציבות של המיקרולוויינים (MI ) ניגזרת מנזק ל- DNA, ומושג זה ניקשר לכמה מחלות סרטן, במקומות ללא קשר ביניהם. הקישור בין אירועים חימצוניים, ו- MI, נמצא במגמת עלייה, עם נזק חימצוני ל- DNA, שניראה שמעלה את שכיחות אי היציבות של המיקרולוויינים, באמצעות השראת מוטציות ברצפים החוזרים, ו- LOH בלתי רציפים,המתוארים כחתימת תבנית מוטציות של נזק חימצוני (Turker et al 1999).


אפקטים אפיגנטיים של נזק חימצוני ל- DNA 

בעוד האפקטים המוטגניים של נזק חימצוני ל- DNA, כבר הוכרו ברובם, המחקרים עכשיו מרחיבים את מספר הדרכים בהן פגיעות אליו בהיותן מוצעות לאפקטים האפיגנטיים המיוחדים למוטציה. במרכז עבודה זו ישנו המימצא שכאשר נחשפים תאי יונקים בתרבית למחמצנים, הם מבטאים גנים מושרי דחק, או גנים המקודדים להגנות נוגדי חימצון. תגובות הסתגלותיות לפגיעות חימצון. תגובות הסתגלות כאלו לפגיעות חימצוניות, אינן מפתיעות, ונראו גם בפגיעות אחרות לא חימצוניות. אולם, נשאר למסד אם לנזק ל- DNA כשלעצמו יש מעורבות בביטוי גני , או אם זה רק מוצר לוואי של יצירת ROS בזמן דחק. כמובן, ה- ROS עצמם מהווים מוליקולות סיגנל תוך תאיות, למרות שאם רמות מספיקות של ROS יכולות להיות מושרות על ידי פגיעה חימצונית, ביטוי גני כזה מושפע מכך, ולא בטוח שהוא ודאי (Ward 1994). אולם שברים חד גדיליים שנוצרו ב- DNA, לדוגמא על ידי קרינה מייננת בעוצמת 2Gy, תהיה בכמה סדרי גודל יותר גדולה מרמות פנימיות, ולכן מועמדת יותר מתאימה לפגיעה בהעברת הסיגנל. נוכחות פגיעות באיזורים של הגנים שעוברים טרנסקריפציה, עלולה להביא למוטציה, אולם האם לפגיעות באיזורים שאינם עוברים טרנסקריפציה יש אפקט ? נוכחותבאלמנטים של הפרומוטר, עלולה להשפיע על קשירת האנזים הגורם לטרנסקריפציה ל-  (DNA  (Ghosh and Mitchell 1999. נראה ששייר יחיד  , בתוך איזור ההתחברות בפרומוטר של הגן 1-AP, יכול למנוע התחברות של ה-RNA-פולימראז (לגדיל המקודד של ה- DNA), ובכך למנוע את הטרנסקריפציה. איזורים כאלה, בהיותם עשירים ברצפי GC, הם מייצגים מטרה ניכרת ל- ROS. תמיכה נוספת למנגנון כזה ניגזרת מהתמרת dG, ל-, באותו מקור של רצף ב- DNA, של הפרומוטר של הגן 1 SP. לאפקט זה יש תוצאות פתולוגיות, כפי שנמצא בהתערבות בהתקשרות של 1 SP ו- NF-κB, בתאי כלייה וכבד של חולדות, שכנראה בגלל נזק הניגרם ל- DNA מ- ROS. אלה אספקטים של נזק חימצוני שנחקרו די מעט עד עכשיו, והתוצאות מצביעות על הפוטנציאל של המחמצנים להשפיע על ביטוי גני או באמצעות יצירת ROS או על ידי התערבות בהתקשרות RNA-פולימראז, ומכך לטרנסקריפציה. תוצאות אילו תומכות בהנחה שאירועים ברמת ה- DNA, שאינם מוטציות, מעורבים בפתוגנזיס (יצירת מחלות). 


Comments