01. יצירת רדיקלים חופשיים


יצירת רדיקלים חופשיים

החומרים בכדור הארץ מורכבים מ- 112 יסודות, הנמצאים בטבע בניפרד או בתירכובות.  כל יסוד בנוי אטומים, אותם שלא ניתן לחלק יותר באמצעים כימיים (ביוונית: אטום – לא ניתן לחלוקה). גרעין כל אטום מוקף באלקטרונים הטעונים מטען חשמלי שלילי, המסתובבים במסלולים שבכל אחד יש שני אלקטרונים לכל היותר, המסתובבים בכיוונים הפוכים, ומהווים זוג. לאטום המימן יש רק מסלול חיצוני אחד, אולם לאטומי החנקן, פחמן וחמצן יש ארבעה מסלולים חיצוניים יותר, עם קיבולת של 8 אלקטרונים. במרכזי האטומים ישנם פרוטונים, טעוני מטען חיובי, נאוטרונים, להם אין מטען חשמלי, ואלקטרונים הנעים מסביב, בקליפות שונות. כלפי חוץ מיטענו של האטום, מאוזן, והוא אפס. האטומים יציבים ביותר רק בצורה הבסיסית שלהם, אם מסלוליהם מלאים. כאמור, לכל אלקטרון בקליפה החיצונית, יש בן זוג משלים המסתובב בכיוון הנגדי. בין אטומים של אותו יסוד או של יסודות שונים, יכול להיווצר קשר (קוואלנטי) בו כל אחד מהם תורם אלקטרון להשלמת הקליפה החיצונית והיא משותפת לשניהם. קרינה חזקה כגון קרינת-X (רנטגן) יכולה לסלק אלקטרון מהקליפה החיצונית של אטום, שהוא בעל מטען שלילי, ואז האטום נעשה בעל מטען חיובי, והוא נקרא יון (חיובי). קרינה כזאת נקראת קרינה מייננת, דהינו יוצרת יונים. רדיקלים חופשיים עשויים להיות נאוטרלים במיטענם החשמלי, או טעונים חיובית, או שלילית. 

יצירת רדיקל חופשי נעשית באחת משלוש דרכים אלו:

  1. הומוליזיס של קשרים קוואלנטים                     A:B   → A + B
  2. הוספת אלקטרון בודד לאטום נאוטרלי                    +•A + e → A 
  3. איבוד אטום בודד מאטום נאוטרלי                        A   → A•+ +e

יצירת יונים ורדיקלים חופשיים קורית גם  במוליקולת מים H2O: בסביבה נאוטרלית, רק חלק קטן (10−7 :1) מהמוליקולות עובר דיסוציאציה לשני יונים, כפי שמודגם בנוסחא: 

+H:O:H → :OH + H

אולם, בחשיפה לקרינה מייננת, מוליקולת המים יכולה לעבור דיסוציאציה לשני רדיקלים חופשיים: רדיקל ההידרוקסיל, ואטום מימן, כפי שמודגם בנוסחא: 

H:O:H → .OH + .H

מההגדרות אלו, מתקבל, שרדיקל חופשי הוא כל אטום (חמצן, חנקן וכיוב', חופשי,  או שנמצא בתוך מוליקולה), שיש לו לפחות אלקטרון אחד בלתי מזווג. הרדיקל אינו יציב, מגיב במהירות, ומשך חייו קצר מאד, עד שהוא "גונב"  אלקטרון מאטום או מוליקולה אחרת. רדיקל חופשי נוצר בקלות כאשר קשר קוואלנטי בין אטומים נשבר, ואלקטרון אחד נשאר בכל אטום שהשתחרר. לכן רדיקלים חופשיים מאד פעילים, והרסניים, בגלל האלקטרון(ים) הבלתי מזווגים שיש להם, עש שמשלימים את האלקטרון החסר, מתרכובת שכנה. כשזה קורה בתאי הגוף, ניגרמים נזקים למאקרומוליקולות בתאים. הנזקים מצטברים, גורמים להיזדקנות, למחלות גיל, ולמוות  (Halliwell and Gutteridge 2007). המזיקים העיקריים הם הרדיקלים שיש במרכזם אטום חמצן, שהם סוגי החמצן הפעיל ROS. חשוב לדעת, שבאטום חמצן יש שני אלקטרונים בלתי מזווגים בקליפה החיצונית, שנעים באותו כיוון במסלולים (orbitals)  מקבילים,  כך שניתן לראותו כרדיקל חופשי כפול. כך הרדיקלים החופשיים הם אטומים או מוליקולות פעילים ביותר, בגלל האלקטרון הבלתי מזווג, במסלול החיצוני, שאינו תורם לקשר המוליקולרי, לכן נקרא חופשי. אטומים או מילקולות קטנות שהם רדיקלים חופשיים, נוטים להיות בלתי יציבים ביותר, לעומת מוליקולות גדולות, כיוון שבגדולות יותר, יש קיבולת כדי ליצור מבנים תהודתיים (resonant). חמצן מוליקולרי נורמלי, המכונה כאן חמצן שלשתי (3O2 triplet oxygen), נחשב כאמור לרדיקל חופשי מאד בלתי רגיל, וכפול, בגלל אותם שני האלקטרונים הבלתי מזווגים במסלולים המקבילים החיצוניים.

בהגדרת הרדיקלים החופשיים נכללים גם אטום מימן, ורוב יוני מתכות המעבר, כמתואר להלן. 

מוליקולות רבות בעלות כושר חימצון, ניתן להפוך בקלות לרדיקלים חופשיים, כולל:
  • חמצן O2
  • מימן על חמצני H2O2,
  • חומצה תת כלורית HOCl,
  • חומצה תת ברומית HOBr,
  • אוזון O3,
  • פראוקסיניטריט -ONOO,
  • חומצה על חנקתית peroxynitrous acid , ONOOH,
  • על-חמצנים אורגניים organic peroxides , ROOH,
  • חומצה חנקית nitrous acid , HNO2,
  • אניון ניטרוקסי -nitroxy anion ,NO.


מתכות מעבר מזרזות יצירת רדיקלים חופשיים 

לכל מתכות המעבר, חוץ מנחושת, יש אלקטרון אחד בקליפה החיצונית, ולכן ניתן להחשיב אותן כרדיקלים חופשיים. לנחושת יש קליפה חיצונית מלאה, אולם היא מאבדת או מקבלת אלקטרונים בקלות, וזה הופך גם אותה לרדיקל חופשי. בנוסף לכך, לברזל יש יכולת לקבל ולאבד אלקטרונים (+Fe2+«Fe3) בקלות. תכונה זו עושה את הברזל והנחושת לזרזים של ריאקציות החימצון. ברזל הוא מרכיב חשוב בהמוגלובין הנמצא בכדוריות הדם האדומות, ונחושת משמשת בתפקיד דומה בדמם של פרוקי רגליים (סרטנים, חרקים וכיוב'). ישנה היפותיזה לפיה במצב דחק, יש התפרקות כדוריות דם אדומות, ומשתחרר מהן ברזל. הוא מזיק לממברנות של התאים, כי גורם לאפקטים המסייעים לחימצון. לעומת זאת אבץ, יכול להתקיים רק בערכיות שתיים (+Zn2), לכן אינו מזרז יצירת רדיקלים חופשיים. אבץ יכול לפעול כדי להפסיק יצירת רדיקלים חופשיים, על ידי דחיית מתכות המעבר הנ"ל, שיש להן יותר מערכיות אחת. גם נטילת ברזל בתוך תוספי מזון, עלולה להזיק לתאים על ידי זרוז יצירת רדיקלים חופשיים כמתואר לעיל. תירכובות רבות שאינן רדיקלים חופשיים, עלולות בנוכחות יוני מתכות מעבר, להפוך גם הן לרדיקלים חופשיים, שחלקם פעילים מאד, כפי שמוצג בטבלא הבאה:

בטבלה: שדרוג תרכובות לרדיקלים פעילים יותר

הפעילות של הרדיקלים החופשיים ניתנת לכימות על ידי מחצית חיים (הזמן שנילקח למחצית מהרדיקלים שנישארו להגיב) בטמפרטורת גוף האדם 37ºC, כמוצג בטבלא הבאה. זמן קצר של מחצית החיים מעיד על פעילות גבוהה. מחצית החיים של הרדיקל הידרוקסיל היא נאנו-שנייה (=ביליונית השנייה, 10-9sec), כלומר הוא כל כך פעיל, עד שהוא מגיב במהירות הגבוהה ביותר עם המוליקולה הראשונה שהוא ניתקל בה. 

לעומת פעילות מתכות המעבר, חלבונים שונים שיכולים לקשור מתכות אלה אליהם, כגון: 

  • Caeruloplasmin
  •  lactoferin
  •  metallothionein
  •  transferring
  •  haemoglobin
  •  myoglobin
  •  cytochrome oxidases
  •  erritin 

מתכות מעבר נקשרות חזק לחלבונים אלה, וזה מונע מהן להגיב עם פראוקסידים כדי ליצור רדיקלים חופשיים.

בטבלה משך מחצית החיים של רדיקלים חופשיים נפוצים


בטבלה למעלה רואים שזמן מחצית החיים של רדיקל ההידרוקסיל היא מיליונית שנייה, דהיינו הוא הפעיל ביותר מבין הרדיקלים המוצגים בטבלה. 

המקומות בתא בהם נוצרים הרדיקלים, והמקומות בהם נוצרים נוגדי החימצון, מפורטים בתרשים הבא:

אתרי יצירת רדיקלים חופשיים בתאים, ויצירת נוגדי חימצון (Finaud et al 2006)


המסלולים הביוכימיים ליצירת הרדיקלים החופשיים, והקשרים ביניהם, מתוארים בתרשים הבא:

מסלולי יצירת רדיקלים חופשיים (Temple et al 2005)


מחוץ למיטוכונדריות, מיוצרים על-חמצן, ומימן פראוקסיד, על הרטיקולום האנדופלזמטי, על ידי תהליכי חימצון בהם מעורב הציטוכרום P-450, והאנזים NADPH-ציטוכרום C רדוקטאז. הצטברות בלתי נורמלית של מטבוליטים נורמליים כגון לאקטאט, פירובאט, אצטואצטיל-קו A, וגליצראלדהיד-3-פוספאט, עלול להגדיל באופן בלתי נורמלי את רמות האנזים NADH-אוקסידאז, ו- flavo -אנזימים, כגון קסאנטין אוקסידאז. בהיעדר מספיק סובסטרטים מקבלי אלקטרונים, אנזימים אלה יכולים להעביר אלקטרונים ישירות למוליקולות חמצן (O2) או יון ברזל מחומצן (+Fe3) כדי ליצור על-חמצן, או +Fe2. אסקורבאט (ויטמין C) יוצר H2O2 בחימצון עצמי (בהתחברות ישירה עם חמצן). גם אסקורבאט, וגם מרקאפטאנים (תיו-אלכוהולים, כלומר, תירכובות בעלות קבוצות SH-, כאשר גופרית מוחלפת בחמצן של אלכוהול), יכולים לחזר +Fe3 ל- +Fe2, ו- +Cu2 ל- +Cu, ובכך מעודדות ריאקציות פנטון. 

רדיקלים חופשיים נוספים נוצרים בריאקציות האנזימטיות של אוקסידאזות ואוקסיגנאזות, ציטוכרום 450 P, ריאקציות אוטו-אוקסידציה של FMH2, FAD, קאטכולאמינים, טטראהידרופטרידינים (כגון, טטראהידרוביופטרין), ותירכובות תיול, כגון ציסטאין. אוטואוקסידציה מוגברת מאד על ידי יונים של מתכות מעבר, בפרט מנגן, ברזל, ונחושת. חלבוני haeme: לפי ההערכה, כ- 3% של ההמוגלובין (Hb) באריתרוציטים (תאי הדם האדומים) עובר חימצון בכל יום, וחושף תאים אלה לזרימה קבועה של רדיקל על-חמצן (-•02). רדיקל זה נוצר על ידי מקורות שונים בתא כמפורט בתרשים הבא:

באיור רדיקל על-חמצני נוצר בריאקציות אנזימטיות בתאים של כלי הדם (Leopold and Loscalzo 2005) 

האנזים NADPH אוקסידאז מורכב מתת-יחידות מרובות, ציטופלזמיות וקשורות ממברנה. האנזים מופעל כאשר תת היחידות p67 ו- p47, וה- G-protein rac, מתחברים עם היחידה המחוברת לממברנה -   (NOX (vascular homolog of gp91phox, ול- p22phox . ה- NADPH אוקסידאז משתמש ב- NADPH כסובסטרט, ובתאים של כלי הדם, נחשב כמקור חשוב ליצירת ROS. האנזימים ליפואוקסיגנאז, ווציקלואוקסיגנאז ( COX) מייצרים ROS באופן בלתי ישיר, על ידי עידוד יצירת מתווכי דלקת inflammatory mediators. חומצה אראכידונית (AA) שנחתכת מהממברנה על ידי פוספוליפאז PLA2) A2) מטופל על ידי האנזים 5-ליפואוקסיגנאז () בנוכחות החלבון השותף שלו ( FLAP), כדי ליצור לאוקוטריאנים (LTs). ה-AA מטופלת על ידי הציקלואוקסיגנאזות כדי ליצור משפחה אחרת של תירכובות מתווכי דלקת, הפרוסטאגלנדינים (PGs) . המיטוכונדריות גם הן מייצרות רדיקל על-חמצני, על ידי העברת אלקטרונים מקומפלקס I לקומפלקס IV בתוך תהליך נשימה נורמלית. האנזים קסאנתין אוקסידאז ( XO), שהופך היפוקסאנתין ו- קסאנתין, לחומצת שתן, וזה מקור נוסף של ROS. כאשר קסאנתין הופך לחומצת שתן, 2 אלקטרונים ניתרמים ליון המוליבדן (Mo) הנמצא באתר הפעיל של האנזים, שמחזרים אותו מ- (Mo(VI, ל- (Mo(IV. לבסוף, האנזים (nitric oxide synthase (eNOS, מתאי האנדותליום, כאשר הסובסטרט, או קופקטורים אינם מתחדשים, ניפרד, כדי ליצור רדיקל על-חמצני, בנוכחות NO. ה- Q, מציין קואנזים Q, ה- C – ציטוכרום-C, ה- FAD – פלאבין אדנין דינוקלאוטיד, FMN- פלאבין מונונוקלאוטיד, FE – יון ברזל ב- haeme, ו- BH4 – טטראהידרוביופטרין.

מצב האלקטרונים במוליקולת חמצן O2, וברדיקלים החופשיים

מצב האלקטרונים בקליפה החיצונית של החמצן, ובתירכובות המכילות חמצן, מתוארים בנוסחאות המבנים של לואיס    (Lewis structures). נוסחאות אלו מציגות מסלול יחיד שבו נמצאים אלקטרונים מזווגים או בלתי מזווגים. היות ומסלול הכולל אלקטרון בלתי מזווג, אינו יכול להיות מושלם על ידי אלקטרון בעל סיבוב נגדי, האלקטרון נחשב כנמצא ב-"מצב סיבוב בלתי יציב" (כינוי נוסף לרדיקל חופשי). כך כימיקלים שמגיבים ומייצבים רדיקלים חופשיים, נקראים חומרים לוכדי סיבוב (spin-trapping substances ), הניכללים בנוגדי החימצון.

בטבלה: •  – אלקטרון עודף ברדיקל חופשי.


המבנים של לואיס (Lewis structures):

קשרי המתוארים בתרשים לעיל נוצרים ממסלולי p חופפים, אולם במוליקולת חמצן נורמלי (O2) המכונה כאן חמצן שלשתי (triplet oxygen, - 3O2), נוצרים שני  קשרים פאי, משני מסלולי  p, החיצוניים, שכל אחד מהם מכיל רק אלקטרון אחד, ושניהם סובבים באותו כיוון. לשני האלקטרונים יתכנו 3 מצבי סידור:

  1. בו שניים סובבים "למעלה",
  2. שניים סובבים "למטה"
  3. אחד סובב "למעלה", ואחד סובב "למטה", שעושה את - 3O2, מעט יותר יציב.

אולם על ידי הוספת אנרגיה (22.5 kcal/mole), שני האלקטרונים נעים לתוך מסלול p יחיד, כאשר האלקטרונים נעים בסיבובים מנוגדים, הנותנים מוליקולת חמצן יחידני ( singlet oxygen (1Oהקרובה לרדיקל חופשי, כמוצג לעיל. האלקטרונים החיצוניים שלה נמצאים במצב מרוגש, ולכן הם יכולים לגרום נזקי חימצון בדומה לרדיקלים החופשיים. מאידך, אם מוסיפים - אלקטרון למוליקולת חמצן נורמלי (=חמצן שלשתי = 3O2), הוא משלים מסלול אחד, ומשאיר את המסלול השני עם אלקטרון בלתי מזווג – וזה מתבטא במצב של יון על-חמצני (  -* superoxide anion (O2, שהוא רדיקל חופשי מקובל ויחודי. חמצן יחידני נימשך לקשרים כפולים, ולכן, יכול להגיב באופן הרסני עם DNA ועם חלבונים. חמצן יחידני יכול להגיב במיוחד עם חומצה אמינית היסטידין, שגורם לדנטורציה של אנזים שחומצה זו נמצאת בהרכבו, דהיינו כנראה לכל אנזים. חמצן יחידני הנוצר על ידי חשיפה לקרינת על סגול, נחשב לגורם העיקרי התורם להיזדקנות העור בחשיפה לאור ( Berneburg 1999). 

כאשר רדיקל חופשי "גונב" אלקטרון ממוליקולה של תרכובת אחרת, נוצר רדיקל חופשי חדש במקומו, שגם הוא מחפש לחזור מייד למצבו הטבעי הבסיסי, וגונב אלקטרון(ים) הסובבים הפוך, מאטומים במוליקולות שכנות. כך ממשיכה שרשרת ריאקציות, גם אלף פעמים ויותר. שרשרות של העברת אלקטרונים (ETC (electron transport chain נמצאת בממברנות הפנימיות של המיטוכונדריות, שהן איברונים הנמצאים בכל תא חי, ומייצרים אנרגיה. הם אוגרים את האנרגיה בתוך מצברים מוליקולריים ה- (ATP (adenosine triphosphate., שניתנים לשימוש בעת הצורך.

אטום החמצן משמש כמקבל אלקטרון סופי בשרשרת ההעברת האלקטרונים. נמצא שכ- 2-5% ממוליקולות החמצן הנישאף לגוף בנשימה, עלולים להימלט משרשרת העברת האלקטרונים במסלול ubiqunone-cytochrome c. כך הם יוצרים, כאמור, את הרדיקל חופשי העל-חמצני (superoxide ), שהוא מזיק מאד. בעת פעילות גופנית, או חשיבתית, עולה צריכת החמצן פי - 10-20 פעמים, עד כדי 35-70 מ"ל\ק"ג\דקה. בהתאם עולה מספר אטומי החמצן הנימלטים משרשרת העברת האלקטרונים, פי 0.6-3.5 מ"ל\ק"ג\דקה מכלל החמצן הנינשם בפעילות, ונוצרים יותר רדיקלים חופשיים, בהתאם. 


טיפוסי הרדיקלים החופשיים

החשובים בין הרדיקלים החופשיים, הם אלה, שיש חמצן במרכזם. הנפוצים בהם, כוללים יון שלילי שהוא העל-חמצן ( -superoxide anion (.O2, רדיקל ההידרוקסיל (•hydroxyl radical (OH, חמצן יחידני ( singlet oxygen (1O2, ומימן על-חמצני (פראוקסיד) H2O2  ("מי חמצן"). יוני העל-חמצן נוצרים מחמצן מוליקולרי רגיל (O2) המקבל אלקטרון נוסף, והמוליקולה נמצאת עם אלקטרון אחד בלתי מזווג. בתוך המיטוכונדריות, היון על-חמצן(-O2* ), נוצר כל הזמן, בקצב התלוי בכמות החמצן הזורם בהן, בכל זמן. חיי הרדיקלים ההידרוקסיליים קצרים, אולם הם המזיקים ביותר בגוף. הם נוצרים מ- O2- ומ- H2O2 , בריאקציה של Harber-Weiss, וגם בפעילות גומלין עם מתכות מעבר כגון, נחושת או ברזל ו - H2O2, בריאקציה של Fenton (ראה להלן). ריאקציות אלו ניכרות היטב, כי המגיבים כבר נמצאים בגוף, ויכולים בקלות להגיב. ה- H2O2, נוצר בגוף בריאקציות שונות, בפרט בעור הנחשף לאור השמש. ייחודו בכך שהוא ניתן למעבר להידרוקסיל שהוא מזיק מאד, או שהופך בריאקציה קטליטית למים, המופרשים בשתן. זה נעשה בפעולת האנזים גלוטתיון פראוקסידאז (ראה להלן) המחמצן גלוטתיון, בתהליך בו בו ה- H2Oמאבד חמצן אחד, והופך למים. אם ה- H2Oאינו הופך למים, נוצר חמצן יחידני (1O2) שאינו בדיוק רדיקל חופשי, אולם יכול להיווצר בריאקציות היוצרות רדיקלים. הוא עובר על חוק Hund, של מילוי האלקטרונים לפיו יש 8 אלקטרונים בקליפה החיצונית, המתקיימים בזוגות, המשאירים מסלול אחד ריק, שהוא באותה רמת אנרגייה. כאשר חמצן עובר עירור אנרגטי, אחד מהאלקטרונים יכול לקפוץ למסלול ריק, ביצרו אלקטרונים ללא זיווג. חמצן יחידני יכול להעביר את האנרגיה למוליקולה חדשה, ולפעול כקטליזטור (זרז) ליצור ממנה רדיקל חופשי חדש, וזה יכול לפעול עם מולקולות אחרות ולגרום בכך ליצירת רדיקלים חופשיים חדשים. גם תחמוצת החנקן (NO) היא רדיקל חופשי, שפעילותו נמוכה, יחסית, ומחצית חייו היא כמה שניות. אולם הוא כרגיל מגיב במהירות עם מוליקולת חמצן (O2) . אולם אם ה- NO נתקל ברדיקל העל-חמצני (-O2) הם מגיבים ויוצרים ביחד פראוקסיניטריט (-ONOO), שהוא למעשה סוג של חנקן מגיב (Reactive Nitrogen Species (RNS. גם הוא יוצר נזק כמו הרדיקלים החופשיים, כי הוא מתפרק ויוצר רדיקל הידרוקסיל ( -*OH),שהוא פעיל מאד, ומזיק ביותר. הפראוקסיניטריט, כרדיקל חופשי, יכול להגיב ישירות עם חלבונים ומאקרומוליקולות אחרות בתא החי, כדי ליצור קרבונילים carbonyls (אלדהידים, וקטונים aldehydes & ketones), וליצור קשרים מצטלבים, ופראוקסידציה של ליפידים, ושברים ב- DNA. רק כ- 1-4% מהנזקים מהניגרמים על ידי פראוקסיניטריט, הם בגלל רדיקל ההידרוקסיל, וזה מצביע על אפקט קטן שיש להתפרקות, על הנזק הכללי שגורם הפראוקסיניטריט ל- DNA     (Roussyn et al 1996). הוא גורם למעשה את רוב הנזק לתאים אנדותליאליים (של כלי דם), בהיותו מזיק כמו רדיקל ההידרוקסיל, ומאיץ בכך טרשת עורקים. למרות שמוליקולות מימן פראוקסיד (H2O2 ), ויון ההיפוכלוריט (-OCl, המרכיב הפעיל בנוזל החיטוי המלבין "אקונומיקה"), אינן רדיקלים חופשיים בעצמן, הן מאפשרות יצירת רדיקלים חופשיים. יותר מכך, ההיפוכלוריט HOCl (למעשה היון שלו ( -OCl) רעיל פי כמה מאות ממימן פראוקסיד או מיון העל-חמצן   (Reiter 2000).


מדידת הרדיקלים החופשיים 

לרדיקלים החופשיים יש משך חיים קצר מאד, הנמדד במקרים רבים בחלקי מיליון או ביליון של שנייה, כפי שהוצג בטבלא לעיל, לכן קשה מאד למדוד את ריכוזיהם במעבדה. אולם ישנן שיטות מדידה מתוחכמות למדידתם, לכל שיטה יתרונות וחסרונות. מדידה ישירה בטכניקה של (electron spin resonance (ESR מגלה נוכחות של אלקטרונים בלתי מזווגים. יש להשתמש בתרכובות ממקור חיצוני, שיש להן אפיניות גבוהה לרדיקלים החופשיים, והן יוצרות איתם תרכובות יציבות, שמראות את "טביעות האצבעות" של הרדיקלים, שאותן ניתן למדוד. אולם שיטה זו אינה מדוייקת. ניתן למדוד לפי לכידת הסיבוב (spin trapping). השיטה מגלה היטב רדיקלים בלתי מגיבים וכן רדיקלים פעילים שאינם מצטברים לרמה ניכרת. המדידה לפי לכידת הסיבוב אינה רגישה מספיק, ותוצאותיה מסופקות. השיטה ניתנת למודיפיקציה על ידי תוספת חומרים "לוכדים" שמיירטים רדיקלים מגיבים, ומגיבים איתם ליצור רדיקלים יציבים אותם ניתן למדוד באמצעות ה- ESR. אולם, טכניקה זו אינה מתאימה למעבדות קליניות, בגלל הצורך בציוד יקר, מומחיות, וזמן. לעומת זאת, מדידה בלתי ישירה (לפי ביומרקרים) מודדת את הנזק שגרמו הרדיקלים החופשיים, לליפידים, חלבונים, וה- DNA, או פעילות נוגדי חימצון.

מכל אלה, השיטה הנפוצה מודדת סמנים של הרדיקלים החופשיים ולא את הרדיקלים עצמם. מדדים אלה של דחק חימצוני, משמשים בשיטות שונות: בפראוקסידציה של חומצה שומנית, היא מתפרקת לאלדהידים, המופרשים מהגוף, כדוגמת חומרים המגיבים עם חומצה (thiobarbituric (TBARS, ואלה מקובלים כסמנים ליצירת רדיקלים חופשיים, וניקבעים בספקטרופוטומטר (MS). אחד מאלה הוא (MDA (malondialdehyde. אולם מבחן TBA זה אינו מספיק ספציפי, אינו מספיק רגיש, ואינו מספיק הדיר (reproducible). הכנסת שיטה של כרומטוגרפיה בנוזל במקום הקביעה בספקטרופוטומטר, מפחיתה שגיאות אלו. מיבחן זה פועל טוב ביותר בממברנות של מיקרוזומים (איברונים תת-תאיים). בפראוקסידציה של ליפידים נוצרים גם גזים כגון פנטאן ואתאן, והם ניפלטים, וניתנים למדידה כאשר נחקרת יצירת רדיקלים חופשיים, והמחקר הראשון מצא עלייה בפנטאן עם הגדלת נפח החמצן שנינשם (Dillard et al 1978). נמצא גם שעליית הסמן MDA בסרום של הדם, היתה בקורלציה עם רמות האנזים קריאטין קינאז (Kanter et al 1988), המשמש סמן לנזק בשרירים. מקובל למדוד דיאן מחובר (MD) , כסמן ליצירת רדיקלים חופשיים. חימצון חומצות שומניות בלתי רוויות ניגמר ביצירת דיאן מחובר, וזה משמש כסמן של השלבים המוקדמים של פרוקסידציה של הליפידים. שיטה חדישה יותר למדידת רדיקלים חופשיים נעשית על ידי שימוש בנוגדנים חד-שבטיים, והיא בשימוש עד שימצאו שיטות מדוייקות יותר. 


 
Comments